Synthèse 7 : INDUCTIONS EMBRYONNAIRES CHEZ LES ANIMAUX ET LES VÉGÉTAUX

Figure 22 : (A) Comparaison de la structure d’un désoxyribonucléotide conventionnel et d’un oligonucléotide Morpholino. La composition chimique modifiée du Morpholino lui confère une grande stabilité in vivo. (B) Les Morpholinos sont conçus pour s’hybrider par complémentarité de base sur des ARNm ciblés. S’ils sont complémentaires de la région contenant le codon initiateur (AUG), la traduction de l’ARNm cible est inhibée (schéma de gauche). Ils peuvent également être conçus pour s’hybrider à des régions contenant un site d’épissage (SS). Ceci conduit à un ARNm incorrectement épissé et une protéine défective (schéma de droite).

Enfin, on peut également réaliser une perte de fonction partielle en jouant directement sur l’activité de la protéine d’intérêt :

• En introduisant des anticorps « bloquants » qui, par interaction spécifique avec la protéine ciblée, l’empêcheront d’exercer sa fonction.
• En utilisant d’éventuels inhibiteurs pharmacologiques de la protéine ciblée.

Les méthodes d’introduction de matériel exogène dans l’embryon

Transférer du matériel génétique exogène dans des cellules en culture est relativement aisé. La technique s’appelle transfection et repose sur divers protocoles. On peut par exemple inclure l'ADN ou des ARN interférents dans des liposomes. Ces micelles, qui possèdent des propriétés structurelles analogues à celles des membranes cellulaires, vont fusionner avec elles, libérant l'ADN dans la cellule. Transférer du matériel génétique exogène dans des cellules in vivo est plus délicat.

Chez certains organismes dont les cellules sont de grandes tailles (comme l’embryon de Xénope aux premiers stades de son développement), on peut directement et facilement injecter du matériel exogène (ADN, ARNm, morpholinos, anticorps bloquants) dans une ou plusieurs cellules ciblées. Seules les cellules filles de la cellule injectée auront une expression génique perturbée (Figure 23).  Ainsi, une injection dans un unique blastomère de l’embryon de Xénope au stade 2, résulte en embryon dont une moitié (gauche ou droite) est perturbée et l’autre intacte. Le même individu sert donc à la fois de test (côté injecté) et de contrôle négatif (côté non injecté).

Figure 23 : Principe de l’injection d’ARNm dans l’embryon de Xénope. Le matériel génétique exogène (ici des ARNm codant les protéines fluorescentes RFP et GFP) peut directement être injecté dans les blastomères de l’embryon. Ici l’injection est réalisée au stade 2 cellules dans les deux blastomères. Notez que toute la moitié gauche de l’embryon dérive du blastomère qui a reçu les ARNm GFP et toute la moitié droite de celui qui a reçu les ARN RFP. Dans une expérience de gain ou perte de fonction, les ARNm ou les morpholinos peuvent être injectés dans un unique blastomère en présence d’ARNm codant la ß-galactosidase ou une protéine fluorescente. Ces rapporteurs permettront d’identifier les cellules qui dérivent du blastomère injecté.

Plus le développement avance, plus les cellules sont petites, et plus il est difficile de réaliser des injections. La technique d’électroporation, utilisée également in vitro sur des cellules en culture, est un type de transfection qui peut être réalisée in vivo dans l’organisme en développement. Elle consiste à appliquer un champ électrique sur les membranes cellulaires qui sont ainsi déstabilisées, ce qui augmente leur perméabilité membranaire. La figure 24 montre sa mise en œuvre sur un embryon d’oiseau. Nous retrouverons cette technique en TD.

Figure 24 : Principe de l’électroporation dans le tube neural d’embryon de poulet (vues dorsales). Le matériel génétique exogène est injecté dans l’embryon (ici dans la lumière du tube neural). Un champ électrique est ensuite appliqué. Il a pour effet (i) de faire migrer l’ADN ou les morpholinos d’un côté seulement de l’embryon (car ces molécules sont chargées ; traits verts) et (ii) de les faire rentrer dans les cellules (car le choc électrique a perméabilisé les membranes). La photo de droite montre un embryon électroporé avec un vecteur codant la ß-galactosidase. L’activité de l’enzyme a ensuite été révélée par une réaction colorée. Notez que seule la moitié gauche du tube neural exprime la ß-galactosidase ; la moitié droite sert de contrôle négatif. Dans une expérience de gain ou perte de fonction, le vecteur d’expression ou les Morpholinos sont co-injectés avec un vecteur codant la ß-galactosidase ou une protéine fluorescente afin d’identifier le côté électroporé.

Analyse du phénotype après un gain ou une perte de fonction génique

Perturber l’expression d’un gène sert à générer un phénotype, à s’écarter de la situation normale en générant des défauts développementaux. Il faut ensuite caractériser le phénotype résultant pour comprendre/déterminer le rôle du gène considéré (Figure 20).

Le premier niveau d’observation est souvent macroscopique (l’embryon peut présenter des défauts visibles à l’œil nu comme un défaut de pigmentation, un problème de polarité, une structure manquante ou surnuméraire…). On peut également réaliser des analyses histologiques sur coupes au microscope ou chercher à savoir si l’expression de divers marqueurs d’intérêt est perturbée (par exemple un marqueur de différenciation si l’on soupçonne que la perturbation génique a affecté la différenciation d’un type cellulaire). Les techniques utilisées pour ce faire regroupent notamment la PCR, l’hybridation in situ ou l’immunofluorescence. Quelle que soit l’option choisie, la démarche d’analyse phénotypique se décline toujours en trois étapes :

• On recense et on qualifie les défauts aux échelles considérées (cellulaire, tissulaire ou macroscopique) par comparaison avec le contrôle.
• On quantifie ces défauts par rapport à la situation contrôle (on quantifie le pourcentage d’embryon présentant le phénotype macroscopique observé, une expression, un nombre de cellules exprimant tel ou tel marqueur, la taille d’une structure, …).
• On conclue sur le rôle du gène dans le processus et à l’échelle considérés.

Les analyses de documents que vous devez préparer en vue du TD5 vous fourniront de multiples exemples de perturbations géniques (gain ou perte de fonction) associées à des défauts phénotypiques; elles seront l’occasion de revoir les différentes méthodes présentées ici autour de questions biologiques concrètes.

Notions de nécessité et suffisance ou la conclusion ultime de l’analyse phénotypique

Lorsqu’on réalise une analyse phénotypique, les défauts décrits permettent de conclure si la fonction du gène est nécessaire et/ou suffisante pour le processus considéré. Prenons quelques exemples :

• Une mutation perte de fonction du gène A conduit à la perte des membres locomoteurs antérieurs chez la souris. La conclusion immédiate de ce résultat/phénotype sera : le gène A est nécessaire à la formation des membres antérieurs chez la souris.
• Une cellule X subit normalement une division asymétrique. L’inhibition de l’expression du gène B promeut la division cette fois-ci symétrique de la cellule X. On conclue donc que le gène B est nécessaire à la division asymétrique de la cellule X. 
• L’expression ectopique du gène C au niveau du flanc de l’embryon poulet conduit à l’induction d’un membre locomoteur supplémentaire du côté testé. Conclusion : le gène C est suffisant à la formation d’un membre. 

NB : Ces mêmes termes s’appliquent en conclusion d’expériences d’ablation ou de greffe de cellules ou tissus. Par exemple :  

• L’ablation d’un groupe de cellules entraîne l’absence de membres locomoteurs antérieurs chez la souris. La conclusion immédiate de ce résultat/phénotype sera : ce groupe de cellules est nécessaire à la formation des membres antérieurs chez la souris.
• La greffe ectopique d’un groupe de cellules induit la formation d’un membre surnuméraire. La conclusion immédiate de ce résultat/phénotype sera : ce groupe de cellules est suffisant à la formation d’un membre.